Версия для слабовидящих
Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.

Исследования структурных изменений в белках

Негативное воздействие техногенной деятельности человека на окружающую среду приводит к накоплению в объектах окружающей среды вредных веществ – экотоксикантов, оказывающих отрицательное необратимое воздействие как на окружающую нас природу, так и на самого человека. Все это ставит перед учеными задачи, связанные с поиском все новых способов ранней диагностики воздействия веществ, оказывающих вредное воздействие на организм человека, – ксенобиотиков.

Результаты фундаментальных исследований, проводимых в лаборатории спектрального анализа, реализованы в разработанном люминесцентном способе определения структурных изменений в белках под действием ряда ксенобиотиков с помощью созданного портативного импульсного фосфориметра. Также разработаны также способы определения полициклических ароматических углеводородов и солей тяжелых металлов, являющихся ксенобиотиками, в объектах окружающей среды.

Разработанные способы и аппаратурное обеспечение востребованы в медицинских диагностических учреждениях, поскольку позволяют выявлять заболевания, связанные со структурными изменениями в белках. Службы экологического мониторинга испытывают потребность в аппаратуре и методах, позволяющих оценить экологическое состояние окружающей среды.

Рис.1 Глобулярная структура альбумина (белок куриного яйца)Белки в организме выполняют структурную, транспортную, каталитическую, регуляторную, защитную, запасную и двигательную функции. Поэтому вполне очевидно, что состояние белков определяет жизнедеятельность организма.

В лаборатории проводятся исследования структурных изменений в транспортных белках – сывороточном альбумине (САЧ) человека (рис. 1 «Глобулярная структура альбумина (белок куриного яйца)»). Выбор САЧ как модельного белка обусловлен его важной ролью в крови.

В структуре помимо дисульфидных мостиков присутствуют свободные сульфгидридные HS-группы цистеина, которые в процессе разложения белка легко образуют сероводород – источник запаха тухлых яиц. Дисульфидные мостики намного более устойчивы и при разложении белка сероводород не образуют. Известен целый ряд физико-химических факторов, оказывающих влияние на белки.

К изменению структуры белков и даже необратимым структурным преобразованиям – денатурации – приводят тепловые воздействия, изменение рН среды, которое возможно в результате стрессов, воздействие избыточной радиации, взаимодействие с поверхностно-активными веществами.

Рис. 2Употребление алкоголя приводит к появлению в крови этилового спирта, молекулы которого взаимодействуют с белками, в результате белок денатурирует (рис. 2) и не выполняет свои функции.

Рис. 3Во время курения вместе с дымом в легкие попадают молекулы полициклических ароматических углеводородов (бензапирен, антрацен, пирен и др.), которые всасываются в кровь и локализуются в белках. Эти вещества являются канцерогенами и стимулируют онкологические заболевания.

Для определения структурных изменений в белках в исследовании используются люминесцентные зонды, нековалентно связанные с белками: они связываются не химическими связями, в основном, эти связи реализуются электростатическими или гидрофобными взаимодействиями.

Для определения структурных изменений в белках используются люминесцентные зонды. Полярные зонды способны связываться с белками в результате кулоновских взаимодействий, то есть притягиваются друг к другу как два разноименных заряда. В свою очередь неполярные зонды локализуются в неполярной (гидрофобной, то есть боящейся воды) области белка.

При поглощении кванта света в полосе поглощения зонд переходит в возбужденное состояние и способен излучать квант света флуоресценции или фосфоресценции. Эти процессы показаны на рис. 3.

Рис. 4В качестве полярных люминесцентных зондов нами чаще всего используется эозин, что в переводе с греческого означает утренняя заря. Неполярным зондом служил антрацен (рис. 4).

  1. Поглощение света зондом.
  2. Флуоресценция (λmax=550 нм) зонда (~10-9с).
  3. Переход в более долгоживущее состояние, из которого возможна фосфоресценция (λmax=690 нм зонда (~ 10-3с) переход - 5. Если рядом на расстоянии 3-10 Å (ангстрем) находится акцептор энергии – антрацен, то возможен перенос энергии на антрацен. В этом случае уменьшается интенсивность свечения эозина (рис. 5).

Рис. 5 Схема анализа структурных изменений белков Просмотр анимации

Размер глобулы белка порядка 100 нм, размер эозина и антрацена не более 4 Å. Введение этих зондов не приводит к структурным изменениям в белках. Поскольку перенос энергии становится невозможным при увеличении расстоянии всего лишь на несколько ангстрем, в результате получается очень чувствительный способ определения незначительных – всего лишь в несколько ангстрем – структурных перестроек белка.

Люминесцентный способ очень чувствительный, современные приборы способны регистрировать очень слабое свечение зондов. Это позволяет использовать люминесцентные методы для определения наличия в крови зондов типа антрацена, относящихся к классу полициклических ароматических углеводородов, попадание которых в организм нежелательно.

Рис. 6По тушению люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции) таких зондов как эозин можно определить содержание солей тяжелых металлов в объектах окружающей среды, в том числе и пищевых продуктах.

В результате получен спектр замедленной флуоресценции (ЗФ) и фосфоресценции эозина в САЧ (рис. 6).

Спектры замедленной флуоресценции (λmax = 560 нм) и фосфоресценции (λmax = 690 нм) эозина (С = 4 мкМ) в растворе фосфатного буфера рН 7.4 САЧ: 1 – без солей тяжелых металлов; 2 – с добавлением соли тяжелого металла

Таким образом, применение процесса переноса энергии между люминесцентными зондами открывает перспективы определения не только конформационных переходов от одной структуры к другой но и позволяет осуществить исследования структурной динамики в миллисекундном временном диапазоне. Над этой проблемой и работают сейчас ученые лаборатории спектрального анализа. Кроме того, участники исследования пытаются значительно увеличить чувствительность определения полициклических ароматических углеводородов и солей тяжелых металлов, а также определить концентрацию частично свернутых белков в плазме крови ответственных за целый ряд заболеваний, в том числе преждевременного старения организма и др.